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中藥制劑前工藝中的新技術(shù)應(yīng)用
更新時(shí)間:2015-03-17 點(diǎn)擊次數(shù):2476

層析技術(shù)的應(yīng)用與發(fā)展,對(duì)于植物各類化學(xué)成分的分離鑒定工作起到重大的推動(dòng)作用。如中藥丹參的化學(xué)成分在30年代僅從中分離到3種脂溶性色素,分別稱為丹參酮Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ。但以后進(jìn)一步的研究,發(fā)現(xiàn)除丹參酮Ⅰ為純品外,Ⅱ、Ⅲ、均為混合結(jié)晶。此后通過(guò)各種層析方法,迄今已發(fā)現(xiàn)15種單體(其中有4種為我國(guó)發(fā)現(xiàn))。新的層析技術(shù)不斷發(fā)展,隨著層析理論和電子學(xué)、光學(xué)、計(jì)算機(jī)等技術(shù)的應(yīng)用,層析技術(shù)已日趨完善。

  一、層析法的基本原理: 層析過(guò)程是基于樣品組分在互不相溶的兩“相"溶劑之間的分配系數(shù)之差(分配層析),組分對(duì)吸附劑吸附能力不同(吸附層析),和寓子交換,分子的大小(排阻層析)而分離。通常又將一般的以流動(dòng)相為氣體的稱為氣相層析,流動(dòng)相為液體的稱為液相層析。

  一、吸附層析法(AdsorptionChromatography)

  (一)吸附劑、溶劑與被分離物性質(zhì)的關(guān)系:液一固吸附層析是運(yùn)用較多的方法,特別適用于很多中等分子量的樣品(分子量小于1,000的低揮發(fā)性樣品)的分離,尤其是脂溶性成分一一般不適用于高分子量樣品如蛋白質(zhì)、多糖或離子型親水住化合物等的分離。吸附層析的分離效果,決定于吸附劑、溶劑和被分離化合物的性質(zhì)三因素。

  1. 吸附劑:常用的吸附劑有硅膠、氧化鋁、活性炭、硅酸鎂、聚酰胺、硅藻土等。

  (1) 硅膠:層析用硅膠為一多孔性物質(zhì),分子中具有硅氧烷的交鏈結(jié)構(gòu),同時(shí)在顆

  粒表面又有很多硅醇基。硅膠吸附作用的強(qiáng)弱與硅醇基的含量多少有關(guān)。硅醇基能夠通過(guò)氫鍵的形成而吸附水分,因此硅膠的吸附力隨吸著的水分增加而降低。若吸水量超過(guò)17%,吸附力極弱不能用作為吸附劑,但可作為分配層析中的支持劑。對(duì)硅膠的活化,當(dāng)硅膠加熱至100~110℃時(shí),硅膠表面因氫鍵所吸附的水分即能被除去。當(dāng)溫度升高至500℃時(shí),硅膠表面的硅醇基也能脫水縮臺(tái)轉(zhuǎn)變?yōu)楣柩跬殒I,從而喪失了因氫鍵吸附水分的活往,就不再有吸附劑的性質(zhì),雖用水處理亦不能恢復(fù)其吸附活性。所以硅膠的活化不宜在較高溫度進(jìn)行(一般在170cC以上即有少量結(jié)合水失去)。

  硅膠是一種酸性吸附劑,適用于中性或酸性成分的層析。同時(shí)硅膠又是一種弱酸性陽(yáng)離子交換劑,其表面上的硅醇基能釋放弱酸性的氫離子,當(dāng)遇到較強(qiáng)的堿注化臺(tái)物,則可因離子交換反應(yīng)而吸附堿性化合物。

  (2)氧化鋁:氧化鋁可能帶有堿性(因其中可混有碳酸鈉等成分),對(duì)于分離一些堿性中草藥成分,如生物堿類的分離頗為理想。但是堿性氧化鋁不宜用于醛、酮、醋、內(nèi)酯等類型的化合物分離。因?yàn)橛袝r(shí)堿性氧化鋁可與上述成分發(fā)生次級(jí)反應(yīng),如異構(gòu)化、氧化、消除反應(yīng)等。除去氧化鋁中絢堿性雜質(zhì)可用水洗至中性,稱為中性氧化鋁。中性氧化鋁仍屬于堿性吸附劑的范疇,本適用于酸性成分的分離。用稀硝酸或稀鹽酸處理氧化鋁,不僅可中和氧化鋁中含有的堿性雜質(zhì),并可使氧化鋁顆粒表面帶有NO3一或CI一的陰離子,從而具有離于交換劑的性質(zhì),適合于酸性成分的層析,這種氧化鋁稱為酸性氧化鋁。供層析用的氧化鋁,用于拄層析的,其粒度要求在100~160目之間。粒度大子100目,分離效果差:小于160目,溶濃流速大慢,易使譜帶擴(kuò)散。樣品與氧化鋁的用量比,一般在1:20~50之間層析柱的內(nèi)徑與柱長(zhǎng)比例在1:10-20之向。

  在用溶劑沖洗柱時(shí),流速不宜過(guò)快,洗脫液的流速一般以每半~1小時(shí)內(nèi)流出液體的毫升數(shù)與所用吸附劑的重量(克)相等為合適。

  (3)活性炭:是使用較多的一種非極性吸附劑。一般需要先用稀鹽酸洗滌,其次用乙醇洗,再以水洗凈,于80℃干燥后即可供層析用。層析用的活性炭,選用顆粒活注炭,若為活性炭細(xì)粉,則需加入適量硅藻土作為助濾劑一并裝柱,以免流速太慢。活性炭主要且于分離水溶性成分,如氨基酸、糖類及某些甙。活性炭的有為吸附作用,在水溶液中zui強(qiáng),在有機(jī)溶劑中則較低弱。故水的洗脫能力zui弱,而有機(jī)溶劑則較強(qiáng)。例如以醇-水進(jìn)行洗脫時(shí),則隨乙醇濃度的遞增而洗脫力增加。活性炭對(duì)芳香族化合物的吸附力大于脂肪族化合物,對(duì)大分子化合物的吸附力大于小分子化合物。利用這些吸附性的差別,可將水溶性芳香族物質(zhì)與脂肪族物質(zhì)分開(kāi),單糖與多糖分開(kāi),氨基酸與多肽分開(kāi)。

  2.溶劑:層析過(guò)程中溶劑的選擇,對(duì)組分分離關(guān)系極大。在柱層析時(shí)所用的溶劑(單一劑或混合溶劑)習(xí)慣上稱洗脫劑,用于薄層或紙層析時(shí)常稱展開(kāi)劑。洗脫劑的選擇,須根據(jù)被分離物質(zhì)與所選用的吸附劑性質(zhì)這兩者結(jié)合起來(lái)加以考慮在用極性吸附劑進(jìn)行層析時(shí),當(dāng)被分離物質(zhì)為弱極性物質(zhì),一般選用弱極性溶劑為洗脫劑;被分離物質(zhì)為強(qiáng)極性成分,則須選用極性溶劑為洗脫劑。如果對(duì)某一極性物質(zhì)用吸附性較弱的吸附劑(如以硅藻土或滑石粉代替硅膠),則洗脫劑的極性亦須相應(yīng)降低。

  在柱層操作時(shí),被分離樣品在加樣時(shí)可采用于法,亦可選一適宜的溶劑將樣品溶解后加入。溶解樣品的溶劑應(yīng)選擇極性較小的,以便被分離的成分可以被吸附。然后漸增大溶劑的極性。這種極性的增大是一個(gè)十分緩慢的過(guò)程,稱為“梯度洗脫",使吸附在層析柱上的各個(gè)成分逐個(gè)被洗脫。如果極性增大過(guò)訣(梯度太大),就不能獲得滿意的分離。溶劑的洗脫能力,有時(shí)可以用溶劑的介電常數(shù)(ε)來(lái)表示。介電常數(shù)高,洗脫能力就大。以上的洗脫順序僅適用于極性吸附劑,如硅膠、氧化鋁。對(duì)非極性吸附劑,如活性炭,則正好與上述順序相反,在水或親水住溶劑中所形成的吸附作用,較在脂溶性溶劑中為強(qiáng)。

  3.被分離物質(zhì)的性質(zhì):被分離的物質(zhì)與吸附劑,洗脫劑共同構(gòu)成吸附層析中的三個(gè)要素,彼此緊密相連。在的吸附劑與洗脫劑的條件下,各個(gè)成分的分離情況,直接與被分離物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)有關(guān)。對(duì)極性吸附劑而言,成分的極性大,吸附住強(qiáng)。

  當(dāng)然,中草藥成分的整體分子觀是重要的,例如極性基團(tuán)的數(shù)目愈多,被吸附的住能就會(huì)大些,在同系物中碳原子數(shù)目少些,被吸附也會(huì)強(qiáng)些。總之,只要兩個(gè)成分在結(jié)構(gòu)上存在差別,就有可能分離,關(guān)鍵在于條件的選擇。要根據(jù)被分離物質(zhì)的性質(zhì),吸附劑的吸附強(qiáng)度,與溶劑的性質(zhì)這三者的相互關(guān)系來(lái)考慮。首先要考慮被分離物質(zhì)的極性。如被分離物質(zhì)極性很小為不含氧的萜烯,或雖含氧但非極性基團(tuán),則需選用吸附性較強(qiáng)的吸附劑,并用弱極性溶劑如石油醚或苯進(jìn)行洗脫。但多數(shù)中藥成分的極性較大,則需要選擇吸附性能較弱的吸附劑(一般Ⅲ~Ⅳ級(jí))。采用的洗脫劑極性應(yīng)由小到大按某一梯度遞增,或可應(yīng)用薄層層析以判斷被分離物在某種溶劑系統(tǒng)中的分離情況。此外,能否獲得滿意的分離,還與選擇的溶劑梯度有很大關(guān)系。現(xiàn)以實(shí)例說(shuō)明吸附層析中吸附劑、洗脫劑與樣品極性之間的關(guān)系。如有多組分的混合物,象植物油脂系由烷烴、烯烴、舀醇酯類、甘油三酸醋和脂肪酸等組份。當(dāng)以硅膠為吸附劑時(shí),使油脂被吸附后選用一系列混合溶劑進(jìn)行洗脫,油脂中各單一成分即可按其極性大小的不同依次被洗脫。

  又如對(duì)于C-27甾體皂甙元類成分,能因其分字中羥基數(shù)目的多少而獲得分離:將混合皂甙元溶于含有5%氯仿的苯中,加于氧化鋁的吸附柱上,采用以下的溶劑進(jìn)行梯度洗脫。如改用吸附性較弱的硅酸鎂以替代氧化鋁,由于硅酸鎂的吸附性較弱,洗脫劑的極牲需相應(yīng)降低,亦即采用苯或含5%氯仿的苯,即可將一元羥基皂甙元從吸附劑上洗脫下來(lái)。這一例子說(shuō)明,同樣的中草藥成分在不同的吸附劑中層析時(shí),需用不同的溶劑才能達(dá)到相同的分離效果,從而說(shuō)明吸附劑、溶劑和欲分離成分三者的相互關(guān)系。

  (二)簿層層析:薄層層析是一種簡(jiǎn)便、快速、微量的層析方法。一般將柱層析用的吸附劑撒布到平面如玻璃片上,形成一薄層進(jìn)行層析時(shí)一即稱薄層層析。其原理與柱層析基本相似。

  1.薄層層析的特點(diǎn):薄層層析在應(yīng)用與操作方面的特點(diǎn)與柱層析的比較。

  2.吸附劑的選擇:薄層層析用的吸附劑與其選擇原則和柱層析相同。主要區(qū)別在于薄層層析要求吸附劑(支持劑)的粒度更細(xì),一般應(yīng)小于250目,并要求粒度均勻。用于薄層層析的吸附劑或預(yù)制薄層一般活度不宜過(guò)高,以Ⅱ~Ⅲ級(jí)為宜。而展開(kāi)距離則隨薄層的粒度粗細(xì)而定,薄層粒度越細(xì),展開(kāi)距離相應(yīng)縮短,一般不超過(guò)10厘米,否則可引起色譜擴(kuò)散影響分離效果。

  3.展開(kāi)劑的選擇:薄層層析,當(dāng)吸附劑活度為一定值時(shí)(如Ⅱ或Ⅲ級(jí)),對(duì)多組分的樣品能否獲得滿意的分離,決定于展開(kāi)劑的選擇。中草藥化學(xué)成分在脂溶性成分中,大致可按其極性不同而無(wú)極性、弱極性、中極性與強(qiáng)極性。但在實(shí)際工作中,經(jīng)常需要利用溶劑的極性大小,對(duì)展開(kāi)劑的極性予以調(diào)整。 4·特殊薄層:針對(duì)某些性質(zhì)特殊的化合物的分離與檢出,有時(shí)需采用一些特殊薄層。

  ① 熒光薄層:有些化合物本身無(wú)色,在紫外燈下也不顯熒光,又無(wú)適當(dāng)?shù)娘@色劑時(shí),則可在吸附劑中加入熒光物質(zhì)制成熒光薄層進(jìn)行層析。展層后置于紫外光下照射,薄層板本身顯熒光,而樣品斑點(diǎn)處不顯熒光,即可檢出樣品的層析位置。常用的熒光物質(zhì)多為無(wú)機(jī)物。其一是在 254nm紫外光激發(fā)下顯出熒光的,如錳激潔的硅酸鋅。另一種為在365nm紫外光激發(fā)下發(fā)出熒光的,如銀激化的硫化鋅硫化鎬。

  ② 絡(luò)合薄層:常用的有硝酸銀薄層,用來(lái)分離碳原子數(shù)相等而其中C一C雙鍵數(shù)目不等的一系列化合物,如不飽和醇、酸等。其主要機(jī)理是由于C一C鍵能與硝酸銀形成絡(luò)合物,而飽和的C一C鍵則不與硝酸銀絡(luò)合。因此在硝酸銀薄層上,化臺(tái)物可由于飽和程度不同而獲得分離。層析時(shí)飽和化合物由于吸附zui弱而Rfzui高,含一個(gè)雙鍵的較含兩個(gè)雙鍵的Rf值高,含一個(gè)三鍵的較含一個(gè)雙鍵的Rf值高。此外,在一個(gè)雙鍵化臺(tái)物中,順式的與硝酸銀絡(luò)合較反式的易于進(jìn)行。因此,還可用來(lái)分離順?lè)串悩?gòu)體。

  ③ 酸堿薄層和PH緩沖薄層:為了改變吸附劑原來(lái)的酸堿性,可在鋪制薄層時(shí)采用稀酸或稀堿以代替水調(diào)制薄層。例如硅膠帶微酸性,有時(shí)對(duì)堿性物質(zhì)如生物堿的分離不好,如不能展層或拖尾,則可在鋪薄層時(shí),用稀堿溶液0.1~0.5NNa0H溶液制成堿性硅膠薄層。例如豬屎豆堿在以硅膠為吸附劑時(shí),以氯仿-丙酮一甲醇(8:2:1)為展開(kāi)劑Rf<0.1,采用堿性硅膠薄層用上述相同展開(kāi)劑,Rf值增至0.4左右。說(shuō)明豬屎豆堿為——堿性生物堿。 5.應(yīng)用:薄層層析法在中草藥化學(xué)成分的研究中,主要應(yīng)用于化學(xué)成分的預(yù)試、化學(xué)成分的鑒定及探索柱層分離的條件。

  用薄層層析法進(jìn)行中草藥化學(xué)成分預(yù)試,可依據(jù)各類成分性質(zhì)及熟知的條件,有針對(duì)性地進(jìn)行。由于在薄層上展層后,可將一些雜質(zhì)分離,選擇性高,可使預(yù)試結(jié)果更為可靠。

  以薄層層析法進(jìn)中草藥化學(xué)成分鑒定,要有標(biāo)準(zhǔn)樣品進(jìn)行共薄層層析。如用數(shù)種溶劑展層后,標(biāo)準(zhǔn)品和鑒定品的Rf值、斑點(diǎn)形狀顏色都*相同,則可作初步結(jié)論是同一化合物。但一般需進(jìn)行化學(xué)反應(yīng)或紅外光譜等一種儀器分析方法加以核對(duì)。

  用薄層層析法探索柱層分離條件,是實(shí)驗(yàn)室的常規(guī)方法。在進(jìn)行柱層分離時(shí),首先考慮選用何種吸附劑與洗脫劑。在洗脫過(guò)程中各個(gè)成分將按何種順序被洗脫,每一洗脫液中是否為單一成分或混合體,均可由薄層的分離得到判斷與檢驗(yàn)。通過(guò)薄層的預(yù)分離,還可以了解多組分樣品的組成與相對(duì)含量。如在薄層上摸索到比較滿意的分離條件,即可將此條件用于干柱層析。但亦可以將薄層分離條件經(jīng)適當(dāng)改變,轉(zhuǎn)至一般往層所采用洗脫的方式進(jìn)行制備柱分離。利用薄層的預(yù)分離尋找柱層的洗脫條件時(shí),假定在薄層上所測(cè)得的Rf值一樣品在柱層中的比移率(R)。這是由于在薄層展開(kāi)時(shí),薄層固定相中所含的溶劑經(jīng)過(guò)不斷的蒸發(fā),而使薄層上各點(diǎn)位置所含的溶劑量是不等的,靠近起始線的含量高于薄層的前沿部分。但若嚴(yán)格控制層析操作條件,則可得到接近真實(shí)的Rf值。用薄層進(jìn)行某一組分的分離,其Rf值范圍,一般情形下為0.85>Rf>0.05.此外,薄層層析法亦應(yīng)用于中草藥品種、藥材及其制劑真?zhèn)蔚臋z查、質(zhì)量控制和資源調(diào)查,對(duì)控制化學(xué)反應(yīng)的進(jìn)程,反應(yīng)副產(chǎn)品產(chǎn)物的檢查,中間體分析,化學(xué)藥品及制劑雜質(zhì)的檢查,臨床和生化檢驗(yàn)以及毒物分析等,都是有效的手段。

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